Izadi Jakintza»Izadi jakintza

Mikroskopioak eta zelulak ikertzeko teknikak

Laburpena: Mikroskopioak zerikusi handia izan du zelulari buruzko ikerketekin biologiaren adar horren sorreratik bertatik. Hooke eta Leeuwenhoek zientzilariek bidea ireki ondoren, XIX.. endeaz gero asko aurreratu zen mikroskopio optikoari buruzko ikerkuntza. Mikroskopio optikoak, baina, 0,2 µm-ko bereizmena besterik ez du, eta hori ez da zelularen barnea aztertzeko nahikoa. Bestalde, mikroskopio optikoen beste arazo nagusietako bat, nahi eta nahi ez lagin hilak behatu behar izatea, beste mikroskopio mota batzuk –fase kontrasteko mikroskopioa, esate baterako– asmatzean konpondu ahal izan zen neurri batean.

Transmisioko mikroskopio elektronikoaren asmaketak (1931) sekulako iraultza eragin zuen zelularen osaerari buruzko ikerkuntzan. Uhin luzera txiki-txikiko elektroi sortak erabiltzeari esker irits dezakeen bereizmen handian oinarritzen da (1 nm-rainokoa). Gero baina, beste mikroskopio elektroniko batzuk ere erabili izan dira: voltaje handikoak, arakatzaileak, etab.

Mikroskopioak egiteko jardunak zenbait teknikaren laguntza behar izan zuen hasiera hasieratik hainbat oztopo –laginen lodiera, laginen endekatzea, zelulako osagaien arteko kontrasterik eza– gainditu ahal izateko. Bestalde, mikroskopioz aztertzeko gaiak behar bezala prestatu behar dira; zenbait teknika erabiltzen da horretarako: finkatzea, deshidratazioa, murgiltzea, ebakitzea, tindatzea eta muntaketa.

Mikroskopia ez ezik beste teknika fisiko eta kimiko batzuk ere landu izan dira molekulak identifikatzeko eta aurkitzeko, metabolismoaren prozesuak ezagutzeko etab. Ultrazentrifugazioa, adibidez, zelularen osagaiek biratze lastertasun handietan banatzeko duten gaitasunean oinarritzen da. Kromatografiak eta elektroforesiak, berriz, duten solbagarritasunaren, karga elektrikoaren edo tamainaren arabera banatzen dituzte nahastura bateko gaiak. Gainera, isotopo erradioaktiboei esker ere zelularen osagaietako asko aztertu eta prozesu metabolikoak ezagutu ahal izan dira.

Kontzeptua eta historia

Egitura txiki-txiki bat da zelula, txikiegia begi hutsez ikusi ahal izateko. Hortaz, zelularen egitura eta funtzionamendua ezagutzeko, tresna bereziak (mikroskopio) eta teknika bereziak landu behar izan dira. Hala beraz, zelulari buruzko ezagutza mikroskopioen aurrerapenen mende egon da.

Badira lau mende mikroskopio optikoa asmatu zenetik. 1590. urtean Zacharyk eta Frances Janseenek lehenengo mikroskopio elkartua egin zuten, hodi batez eta bi lente ganbilez osatua. Gero, Robert Hooke fisikari, matematikari, astronomo eta asmatzaile ingelesak (1635-1703), artelazkizko xafla mehe batzuk behatu zituen mikroskopioz (1655), eta bera izan zen, behaketa haren berri eman zuen lan batean (Micrographia), egitura biologiko bat deskribatzeko zelula hitza erabili zuen lehenengoa.

Garai hartan mikroskopio egileek berek egiten zituten behaketa gehienak. Antoine van Leeuwenhoek ikertzaile herbeheretarrak (1632-1723), mikroskopio arrunt baina bereizmen handikoak erabiliz, mikroorganismo, ziliodun, alga, onddo, bakterioasko aurkitu zituen. Marcello Malpighi (1628-1694) sendagile eta ikertzaile italiarrak ere kapilar, intsektu eta landare ugari behatu zuen.Hookek aurkikuntza hori egin eta hurrengo 150 urteetan zientzialari asko aritu zen behaketak egiten. Eta, hala, XIX.. endearen hasierarako datu ugari eta askotarikoak bildu ziren. Garai hartan egin izan ziren aurrerapen teknikoen artean aipagarria da lente akromatikoen erabilera.

Aurrerapen horiei esker izaki bizidun askoko zelulak behatu ahal izan ziren, zelularen gunea aurkitu zen (Brown, 1831), eta Schleiden eta Swannek zelularen teoria adierazi zuten (1839).

XIX. mendearen bigarren erdian asko aurreratu ziren mikroskopioak eta teknika mikroskopikoak. 1880-1900 bitarteko hamarraldietan, adibidez, mikroskopio optikoarekin ikus daitezkeen organulu gehienak aurkitu ziren. Hain zuzen ere, orduan hasi ziren teknika berriak erabiltzen: tindatzea, ebakitzea, etab.

XX. mendearen hasieran gainbehera egin zuen zelularen egituraren ikerketak, argiaren mugak zirela-eta. 1930-1940 hamarraldiaz gero, baina, aurrerapen handiak egin ziren tresna berri bat, mikroskopio elektronikoa, asmatzean. Mikroskopio optikoak baino askoz ahalmen handiagoa izaki, zelularen egitura ez ezik zelulako organuluetako bakoitza ere ikus daiteke mikroskopio elektronikoarekin.

Fase kontrasteko mikroskopioa aurkitzea ere (1932) garrantzi handiko aurkikuntza izan zen.

Azkeneko hamarraldietan aurrerapen handiak egin dira teknika mikroskopikoetan: zentrifugazioa, elektroforesia, kromatografia, etab. Teknika horiei esker hainbat ikuspegitatik azter daiteke zelula, eta hala, morfologoak, biokimikariak, genetistak eta bestelako biologoak elkartuz doaz zelularen bizi funtzioei buruzko interpretazioan.

Gainera, beste mikroskopio mota batzuk ere agertu dira: mikroskopio elektronikoarakatzailea, kriohausturako mikroskopioa, tentsio handikoa, etab.

Mikroskopio argidunak edo fotonikoak

Mikroskopio optiko elkartua

Aztertu nahi den organismoaren lagin mehe bat zeharkaturik eta lente multzo batek handiturik, argia begiraino igortzean oinarritzen da mikroskopio optikoa. Hiru lente sistema daude gaur egungo mikroskopio elkartuetan: kondentsatzailea, argia biltzen duena, eta objektiboa eta okularra, hurrenez hurren, irudia handitzen dutenak.

Mikroskopiaren handitzea esaten zaio aztergaiak begietara duen tamainaren eta benetan duenaren arteko erlazioari. 2.000 handitze ere izaten dituzte ikerkuntzarako erabiltzen diren mikroskopio optikoek.

Baina handitzeen kopurua edo irudia handitzeko ahalmena baino are garrantzitsuagoa da bereizmena, alegia, aztergaiaren xehetasun txikienak bereizteko ahalmena.

Hau da, kopurua baino are garrantzitsuagoa da kalitatea. Gure begiek 0,1 mm-ko bereizmena dute eta 0,2 µm-koa, berriz, mikroskopio hoberenek, hau da, 500 aldiz handiagoa. Beraz, 0,2 µm-z beherako objektuek ezin ikus daitezke aparatu horiekin; gehienez ere zelulak eta zelula barruko egitura batzuk (gunea, zentrosoma, mitokondriak, etab.). Mikroskopio baten bereizmena uhin luzeraren eta lenteen zenbakizko zabaltasunaren araberakoa da. XIX. mendearen bukaeran lortua zen jada zabaltasunik handiena (0,2 µm). Eta hala, beste irrada mota bat erabiltzen hasi zen artean (mikroskopio elektronikoa), hutsa handitu zen mikroskopio optikoen bereizmena.

Fase kontrasteko mikroskopioa

Urte askotan zelula hilak besterik ezin izan ziren behatu, teknika jakin batzuez trataturik –finkatzea, tindatzea–; gainera, tratamendu hori zela eta, zelularen osagaietako batzuk hondatzeko arriskua izaten zen.

Zelula biziak mikroskopio optiko normaletan behatzen badira, ez da ikusten ia xehetasunik.

Aurreratze handia egin zen 1932an, fase kontrasteko mikroskopio optikoa asmatu zenean. Mikroskopio mota horretan ere argia baliatzen da, baina argi uhinek zelularen osagaietan zehar (gunean eta zitoplasman zehar, adibidez) igarotzean sortzen dituzten interferentziak handizkatu egiten dira, eta, hala, egitura horiek, haien arteko kontrastea gehiago nabarmendurik, ikusgai bihurtzen dira, tindatu beharrik izan gabe.

Gauza bera egin daiteke geroago sortu ziren beste mikroskopio batzuekin, kontraste interdiferentzial eta eremu iluneko direlakoekin.

Gaur egun, mikroskopio batera bil daitezketeknika horiek guztiak. Zelularen bizitzaren prozesu gehienak (mugimenduak, mitosia, fagozitosia, etab.) bideoan hartu eta, hala, irudiak muntatu eta lastertasun handiz erreproduzitu ahal izatea da mikroskopio mota horien abatantaila nagusia.

Mikroskopio elektronikoak

Transmisioko mikroskopio elektronikoa asmatzean (1931. urte aldera), gainditu ziren argiaren uhin luzerak sortzen zituen arazoak eta handitu zen, gainera, mikroskopioaren bereizmena, 1.000 bider handitu ere. Argiarenak baino askoz uhin luzera txikiagoz hedatzen diren elektroi sortak erabiltzen ditu mikroskopio mota horrek.

Zenbat eta handiagoa izan elektroien lastertasuna, orduan eta txikiagoa da uhin luzera.

Mikroskopio horiek 0,002 nm-ko bereizmena irits dezakete teorian (optikoek 100.000 halako), baina, zenbait arazo delaeta, lenteen aberrazioa esate baterako, 1 nm-ra mugatzen da ahalmen hori.

Mikroskopio elektronikoa mikroskopio optikoaren antzekoa da zenbait gauzatan: argi iturriak elektroiak igortzen ditu hutsunea egin zaion hodi batera, eta elektroiak, eremu elektriko batek azelerarazirik, hodian behera jaisten dira. Bobina elektromagnetiko batzuek (lente elektromagnetikoak bailiran) lagina –mehe-mehea– zeharkatzen duen sorta fokatu, eta irudi bat eratzen dute argazki xafla edo pantaila fluoreszente batean.

Lagin biologikoak finkatzaile bereziez tratatu behar dira, eta 50-100 nm lodi inguruko zatitan ebaki (1-10 µm lodi bitarteko zatitan, berriz, optikoan); beraz, ezin dira lagin hilak besterik erabili. Lodiagoak ere azter daitezke voltaje handiko mikroskopikoekin (1-5 µm bitartekoak).

Mikroskopiko elektroniko arakatzailea 1965az gero erabiltzen da eta aurrerapen handia izan zen, aztergaiaren gainaldearen hiru dimentsioko irudiak har baititzake.

Transmisioko mikroskopioak baino bereizmen txikiagoa du (10 nm), eta zelularen organuluak ez baina zelula osoak behatzeko erabili ohi da.

Teknika mikroskopikoak

Argia edo elektroiak zelularen egituretatik zehar igarotzean kontraste gutxiko irudiak sortzen dira, zelulak antzeko gardentasuna baitu bere alde guztietan. Hori bera gertatzen da batzuetan txuri-beltzeko argazkietan ere, alegia, ozta-ozta bereizten direla elkarretatik gorputza, arropa, objektuak, paisajea, etab. Bestalde, zenbait zelulatan, duten lodiera dela-eta (5-100 µm), nekez bereiz daiteke xehetasunik.

Horiek eta horien antzeko beste oztopo batzuk gainditzeko denbora asko behar izan zen, ia 200 urte. XIX. mendearen bukaeran tinduak erabiltzen hasi ziren, osagai bakoitzaren gardentasuna bereizteko. Mikroskopio elektronikoan ere zenbait gai erabiltzen da egiturak intentsitate desberdinez margotzeko.

Tindatzeaz gainera beste teknika batzuk behar izaten dira behaketa hobetzeko.

Aztergai biologikoak ondo finkatua behar du haren egiturak itxura gal ez dezan.

Aztergaia, gainera, epai fin-finetan ebaki behar da, argiari pasatzen uzteko.

Tratamendu horiek zelula hil eta itxuragaiztu egiten dute. Arazo horiek, baina, neurri batean bada ere, gainditu egin dira mikroskopio horietako batzuetan (fase kontrastekoan etab.), eta zelulentzat hilgarriak ez diren koloregaiak erabiliz, Kongo gorria eta gorri neutroa, adibidez.

Laginak edo aztergaiak mikroskopioan behatzeko prestamenak

Gai bat mikroskopioz aztertua izateko behar bezala prestatu behar da aldez aurretik:Finkatzea. Lagin bizia gai kimiko bereziez (finkatzailea) tratatzen da, zelulak hiltzen badira ere itxura gal ez dezaten eta zelulako egiturak ere honda ez daitezen. Finkatzaileak, gainera, gogortu egiten du aztergaia, eta horrela, gogorturik, errazago ebaki daiteke.

Era askotako gaiak erabiltzen dira finkatzaile gisa: alkohola, formaldehidoa etab.. ikroskopio optikoetan, glutaraldehidoa eta osmio tetroxidoa mikroskopio elektronikoetan.

Finkatzeko beste modu bat, lagina nitrogeno isurkariz izoztea da (-160 °Ctan); horrela ez dago finkatzaile kimikoengatikgerta daitezkeen aldaketak gertatzeko arriskurik.Deshidratazioa. Laginari, aztertua izateko, ura kendu behar zaio, eta uraren ordez, murgiltze prozesuan erabiltzen den gaiarekin bateragarria den beste bat erantsi.

Alkohol etilikoa erabili ohi da gehinbat; aztergaiak kontzentrazioa gero eta handiagoa duten alkoholetatik igaroarazten dira, alkohol absolutura iritsi arte.Murgiltzea. Ehunak bigunak eta hauskorrak direnez, nolabait gogortu behar dira ebaki ahal izateko. Deshidratatu ondoren, beraz, argizari edo erretxinatan murgiltzen dira; ehuna argizari edo erretxinaz blaitu ondoren, hoztuz edo polimerizazioz gogortzen da.Ebakitzea. Arestian esan denez, xafla mehe-mehetan ebaki behar da lagina, mikroskopioaren argiak zeharkatuko badu.

Mikra gutxi batzuetako xaflak ebakitzeko gai den tresna berezi bat, mikrotomoa, erabiltzen da horretako. Mikroskopio elektronikoarentzat ultramikrotomoa erabiltzen da; mikrotomoak diamantezko labana zorrotz bat du, 50 nm meherainoko xaflak ebakitzeko.Tindatzea. Mikrotomoz ebaki ondoren, kontrasterik ez duten zenbait egitura behatu ahal izateko, koloregaiz tratatu behar dira epaiak. Era askotako koloregaiak daude, eta zer egitura klase aztertu nahi den, bat edo beste erabiltzen da: eosina, adibidez, zitoplasmarako erabiltzen da, eta hematoxilina eta metileno urdina, berriz, gunerako. Mikroskopio elektronikoaren kasuan metal astunen gatzak erabiltzen dira, era desberdinean finkatzen baitira zelulako osagaietan.Muntaketa. Hau da aztergaia prestatzeko azken urratsa. Euskarri batean kokatzen da eta gairen bat eransten zaio babesgarri gisa; gai horrek lenteen antzeko errefrakzio indizea izan behar du. Luzerako prestatzen diren laginen kasuan Kanadako baltsamua eta Euparal erabiltzen dira gehienbat. Gero, estalki batez estaltzen da lagina.

Mikroskopio elektronikoaren kasuan metalezko saretxo biribil bat erabiltzen da.

Mikroskopio elektronikoetan bada zelula mintzen barnea behatzeko oso ona den teknika bat: kriohaustura. Aztergaia -160 °Ctan izozten da nitrogeno isurkarian, eta laban batez hautsarazten, gero. Askotan, mintzen lipido geruza bikoitzean gertatzen da haustura, eta mintzen barnea behatzeko aukera izaten da horrela.

Beste zenbait teknika

Mikroskopioaz aparte beste zenbait teknika ere erabili izan da zelula aztertzeko, azkeneko hamarraldiotan batez ere.

Zelularen osaera fisiko-kimikoa eta funtzionamendua hobeto ezagutzen lagundu dute teknika horiek.

Ultrazentrifugazioa

Zelulako organuluak tamainaren arabera bereizteko erabiltzen da zentrifugazioa.

Teknika hau, zelulak lastertasun handi-handitan birarazten dituena, 1940. urteaz geroztik hasi zen erabiltzen.

Zenbait tratamenduren bidez (osmosia, ultrasoinuak, etab.) zelulak hautsirik, zatiki nahastura bat geratzen da hodian barreiaturik.

Lastertasun gutxiko –lurraren grabitatearen balioaren halako 600– zentrifugazio baten mende jartzen da nahastura, eta horren eraginez hodiaren hondora erortzen dira zatiki handienak (guneak eta zelulaosoak). Gero, lastertasun handiagoan birarazten da (15.000 g) eta mitokondriak, lisosomak eta peroxisomak erortzen dira. Eta are gehiago handiturik, polisomak (100.000 g) eta, azkenik, erribosomak (300.000 g).Ultrazentrifugazioa

Kromatografia

Nahastura batean dauden gaiak bereizteko teknika bat da kromatografia. Bai molekula txikietarako (azukreak, aminoazidoak) bai makromolekuletarako (proteinak) balio du. Molekula txikientzat erabiltzen den kromatografia mota batean (zatikatze kromatografia), aztertu nahi den laginaren tanta bat jartzen da material zurgatzaile batean, paperean (paper gaineko kromatografia) edo silizeedo zelulosazko geruza batean. Gero, solbaitzaile nahastura batean (ura eta alkohola, esaterako) sartzen da paperaren mutur bat.

Paperak solbatzailea zurgatu ahala laginaren osagaiak bereiztuz doaz, beren solbagarritasun erlatiboaren arabera. Era horretan, paperak ura alkohola baino hobeto zurgatzen badu, uretan solbatuta dauden molekulak zurgatu eta alkoholean solbatuta daudenetatik bereiziko ditu. Azkenean, laginaren osagaietako bakoitzak orban moduko bat eratzen du paperaren gainean.

Hodiko kromatografia, berriz, proteinak bereizteko erabiltzen da. Kromatografia mota honetan zelulosazko gai porotsu batez (edo bestelako batez) beteriko beirazko hodi baten goiko muturrean jartzen da proteinen nahastura, eta solbatzailea eransten zaio nahasturari hodiaren goiko aldetik. Nahastura hodian behera doa, hodia betetzeko erabili den gaiarekin duen elkarrekintzaren araberako lastertasunean, halako moduan ezen, hondoraino iristean, proteinak bata bestetik bereizteko moduan geratzen diren. Teknika horrekin baina, ezin izaten da proteina garbirik lortu, eta zenbait bider errepikatu behar izaten da prozesua hodi desberdinetan. Afinitate kromatografiaren bidez bai, proteina garbiak bereizten dira, zeren gai porotsua gauza baitabereizi nahi den proteina atxiki eta gainerakoak egozteko.

Elektroforesia

Teknika hau molekula kargadunak (aminoazidoak, proteinak, azido nukleikoak, etab.) bereizteko erabiltzen da. Molekula horiek, isurkari batean barreiaturik, eremu elektriko baten mende jartzen direnean, beren kargaren eta masaren arabereko lastertasunaz lerratzen dira euskarri baten gainean (masa berekoak baldin badira, karga handienekoa da azkarren mugitzen dena elektrodorantz). Gaur egun, zer gai bereizi nahi den, euskarri mota desberdinak erabiltzen dira.

Molekula txikiak bereizteko erabiltzen da zelulosa azetatozko elektroforesia. Soluzio eroale batez bustita eta eremu elektriko baten mende dagoen euskarri baten gainean mugitzen dira molekulak, beti ere kargararen arabera.

Poliakrilamida gelezko elektroforesia 60ko hamarraldian asmatu zen, eta hau da, dudarik gabe, proteinak bereizteko metodorik hoberena. Proteinek poliakrilamida gelezko matriz batean migratzen dute; gel horretako poroen tamaina gel kontzentrazioaren arabera kontrolatzen da (zenbat eta handiagoa kontzentrazioa, orduan eta txikiagoak poroak).

Proteinak gelaren poroetan zehar lerratzen dira molekulen tamainaren araberako lastertasunean. Proteinak karga negatiboa duen deterjente batez tratatu behar dira lehenbizi, eta, hala, lagina jarrita dagoen xaflaren polo negatibotik, positiborantz migratuko dute molekulek. Proteinarentamainaren arabera ordenatzen diren zerrendak eratuz bereizten dira molekulak gelean (zenbat eta txikiagoa proteina, orduan eta urrutiago izaten da polo negatibotik), eta molekula pisuari buruzko informazioa lor daiteke horrela.

Aurreko elektroforesi mota horretan (dimentsio bakarrekoa) sortzen diren zerrendak elkarren gainean pilatzen dira, baldin eta laginaren proteina kopurua handia bada (50 baino gehiago); beraz, elektroforesi mota hori ez da oso erabilgarria analisi askotan. Hori konpontzeko bi dimentsioko elektroforesia erabiltzen da, zeina 1.000 proteina desberdin ere bereizteko gauza baita. Bi etapez osatua dago teknika hori: lehenbizikoan, gelez beteriko hodi estu batean bereizten dira proteinak, duten karga elektrikoaren arabera; bigarrenean, berriz, bereizitako proteinak dauden hodi estua elektroforesiaren mende jartzen da berriro –aurrekoari buruz zut–, eta molekula tamainaren arabera migratzen dute proteinek.

Molekula mota bakoitza xaflan geratzen da halako orban txiki moduko bat eratuz; gero, zenbait prozeduraz hauteman daiteke orban hori (koloratzea, autoerradiografia, etab.). Ahalmen handiko metodoa da; aminoazido bakar batean desberdin diren bi proteina ere bereizteko ahalmena du.

Elektroforesi teknika horiek, proteinak bereizteko asmatuak, ingeniaritza genetikoan erabili dira gero, endonukleasek sortzen dituzten DNAren errestrikzio zatikiak bereizteko (funtsezko prozesua da hori DNAren sekuentziaziorako).

Isotopo erradioaktiboak

Molekula biologikoak zeluletan bilatzeko eta nondik nora dabiltzan ikusteko erabiltzen dira isotopo erradioaktiboak.

Desintegratzean irradak igortzen dituzten isotopo erradioaktiboen erabileran oinarritzen da teknika hau. 3H, 14C, 32P eta 35S isotopoak erabiltzen dira batez ere, biologian maiz erabiltzen direnak molekula bakun batzuetan (aitzindari erradioaktiboak: aminoazidoak, nukleotidoak, monosakaridoak, etab.) txertatzen baitira.

Aitzindari erradioaktiboak zeluletan txerta daitezke; zelula ez erradioaktiboen bide bera segitzen dute, eta zelularen metabolismoan txertatzen dira molekula erradioaktibo gisa (proteina, azido nukleiko, etab.). Hainbat metodo ezagutzen da molekula erradioaktibo horiek hautemateko. Ezagunenetako bat autoerradiografia da, hau da, argazki pelikula batez baliatzea molekula horiek zelula epaietan, mikroskopio elektronikoaren bidez, edo elektroforesien geletan aurkitzeko.

Prozesu metaboliko asko berregin ahal izan da teknika honi esker, bai sintesi prozesuak bai degradazio edo endekatze prozesuak.

Hasieran, karbonoak fotosintesian egiten duen bidea segitzeko erabili izan zen, besteak beste. Horretarako, 14CO txertatu 2 zen fotosintesia egiten duten alga batzuetan, C erradioaktiboa beretzen zuten gai organikoak erradiografien bidez bereizteko.

Horrela bereizi ahal izan ziren fotosintesiaren mekanismoan (Calvin-en zikloa) parte hartzen duten osagaiak, hasi CO -tik eta 2 glukosaraino.